vloeistof wordt geschonken in reageerbuisjes op een dienblad

Over

Thema

Nieuwe methodologie voor analyse stofwisselingsproducten in biologisch materiaal

16 december 2021 - Universiteit Leiden en Hogeschool Leiden hebben een belangrijke stap gezet op weg naar de inzet van nieuwe analytische meettechnieken op het gebied van metabolieten.

Metabolieten zijn in feite producten van stofwisselingsprocessen en dus inzicht kunnen geven in onze gezondheidstoestand. Wetenschappers gebruiken steeds vaker 3D-celcultuurmodellen om ziektebeelden beter te begrijpen. Enerzijds omdat 3D-modellen de fysiologische toestand van cellen beter nabootsen ten opzichte van 2D-celcultuursystemen, anderzijds om het gebruik van proefdieren terug te dringen.

Nieuwe analytische meettechnieken

De hoeveelheid cellen aanwezig in 3D-celcultuurmodellen kunnen echter zeer gering zijn; je hebt het dan bijvoorbeeld over slechts een paar duizend cellen. Daarom zijn nieuwe analytische meettechnieken nodig om metabolieten, die in feite producten zijn van stofwisselingsprocessen en dus inzicht kunnen geven in onze gezondheidstoestand, in deze modellen te meten.

Metabolomics workflow, stap voor stap. De HepG2 cellen worden gelyseerd, en de polaire metabolieten worden geëxtraheerd uit het cel extract door middel van vloeistof-vloeistofextractie. Dan wordt het derivatiseringsreagens toegevoegd, en worden de metabolieten met een carbonzuurgroep gederivatiseerd, waardoor zij een permanente positieve lading verkrijgen. Daarna wordt het monster geanalyseerd dmv CE-MS.

Metabolomics workflow, stap voor stap.

De HepG2 cellen worden gelyseerd, en de polaire metabolieten worden geëxtraheerd uit het cel extract door middel van vloeistof-vloeistofextractie. Dan wordt het derivatiseringsreagens toegevoegd, en worden de metabolieten met een carbonzuurgroep gederivatiseerd, waardoor zij een permanente positieve lading verkrijgen. Daarna wordt het monster geanalyseerd door middel van CE-MS. 

Begin van het project

Het project begon met de identificatie van vier derivatiseringsreagentia door Cornelius Willacey, destijds PhD student in de onderzoeksgroep Analytical BioSciences and Metabolomics van prof. Thomas Hankemeier. Cornelius ontdekte dat deze specifieke reagentia mogelijk op efficiënte wijze analyses aan metabolieten gevoeliger en daardoor gemakkelijker konden maken.

Derivatiseringsreagentia zijn op zichzelf niet nieuw. Het zijn moleculen die analieten beter scheidbaar en/of meetbaar maken. Ze doen dit door een chemische binding aan te gaan met analieten, waardoor nieuwe constructen ontstaan die de eigenschappen van het gebruikte reagens deels overnemen. De door Cornelius aangewezen derivatiseringsreagentia zijn echter wel nieuw en zijn niet commercieel verkrijgbaar.

Effectieve samenwerking

Op steenworpafstand van de Chemiefaculteit van Universiteit Leiden, bestond bij het lectoraat Metabolomics van de hogeschool al enige tijd de behoefte om analyseprojecten meer te laten profiteren van aanwezige organische synthesemogelijkheden. Peter Lindenburg, lector van het lectoraat Metabolomics, bracht de universiteit en hogeschool bij elkaar voor een samenwerkingsproject. Na enige tijd kwam PhD kandidaat Marlien van Mever aan boord, werkzaam in de groep van associate professor Rawi Ramautar. Zij heeft één van de reacties voor CE-MS geoptimaliseerd.

Effectieve team science heeft uiteindelijk geleid tot de ontwikkeling van een gevoelige analysemethode, waarmee lastig meetbare stofwisselingsproducten gekwantificeerd kunnen worden in gering monstermateriaal. Met deze methode kan energiemetabolisme in kleine aantallen zoogdiercellen bestudeerd worden. 

De volgende onderzoekers verdienen dank wegens hun bijdrage aan het project: Marlien van Mever, Cornelius Willacey, Wei Zhang, Nicolas Drouin, Alphert Christina, Peter Lindenburg, Jaco van Veldhoven, Daan van der Es, Amy Harms, Thomas Hankemeier en Rawi Ramautar. 

Meer weten

Lees het artikel Profiling acidic metabolites by capillary electrophoresis-mass spectrometry in low numbers of mammalian cells using a novel chemical derivatization approach of lees meer over het onderzoek van het LCAB.